Vectores de clonacion

Vectores como herramientas de la biologia molecular.

Los vectores Son plasmidos que han sido modificados geneticamente, es una molécula de ADN pequeño con respecto al ADN genomico, fácil de aislar y caracterizar, con secuencia y mapa de restricción conocidos, capaz de introducirse en una célula anfitriona. Son  empleados para insertar fragmentos para poder clonarlos o expresararlos en la célula anfitriona. Este inserto puede provenir de diferentes fuentes: ADN genómico, de un producto de PCR, provenir de una restricción o de un fragmento mayor, se debe conocer la secuencia de los extremos para saber cómo poder ligar el inserto a nuestro vector.

Los vectores usados deben poseer cuatro características (figura 1):

1-    Debe tener un origen de replicación para poder replicarse de manera autónoma e independiente del genoma de la célula anfitriona.

2-    Poseer sitios de clonación múltiple, es decir sitios que sean reconocidos por enzimas de restriccion para   que permitan la apertura del ADN n y hacer posible el ADN recombinante.

3-    Debe poseer marcadores de selección que permitan aislar a las células anfitrionas que contengan el vector. Por ejemplo si el vector contiene un gen que le da resistencia para algún antibiótico como la ampicilina a una bacteria, se pueden hacer crecer las bacterias en un medio rico en ampicilina y solo las células que han sido transformadas y por ende contengan el vector podrán crecer en dicho medio. Un buen marcador de selección es aquel que en dosis altas pueda inhibir el crecimiento de los organismos no transformados y lo suficientemente bajas para no afectar a los organismos transformados.

4 -Un gen reportero para identificar a las células que contienen ADN foráneo. Por ejemplo, usando el gen de lacZ, el cual posee varios sitios de clonación múltiple y por ende, al agregar un inserto en estos sitios de clonación se interrumpiría la expresión de la enzima beta galactosidasa. Las células que han sido transformadas con nuestro vector (plásmido con nuestro inserto) no podrán expresar dicha enzima y al colocarlas en un medio sólido como el agar, que contengan sustratos de IPTG y un sustrato artificial de beta-galactosidasa Xgal, las células transformadas se teñirán de blanco mientras las que no posean el vector, se teñirán de azul ya que dicha enzima forma un precipitado de color azul.

Figura 1. Es un ejemplo de un vector, en este caso es un  plásmido el cual sepuede observar que posee tres  características principales de un vector. De rojo está el  origen de replicación, de naranja el marcador de selección (resistencia a ampicilina) y de verde el sitio de clonación múltiple.

Los vectores están diseñados para 3 propositos:

1-    Obtener múltiples copias de un mismo fragmento de ADN

2-    Expresión del producto biologico del gen (proteinas, microRNAs)

3-    Investigar propiedades de un promotor, por ejemplo, saber cuándo se expresa un gen, donde se expresa, por cuanto tiempo se está expresando el gen.

La mayoria de estos vectores estan diseñados para ser transformados en bacterias, particularmente en E. coli.

De acuerdo al objetivo de la investigacion se pueden dividir en:
Vectores de clonación (figura 2) que solo buscan la amplificación el ADN de interés apatir del .ADN recobinante.

.
Figura 2. Los vectores de clonación son utilizados para la obtención de miles de copias de un fragmento de ADN de nuestro interés. Este vector con el inserto logra entrar a la célula anfitriona donde por medio de la maquinaria de la célula va a generar miles de copias del vector

Vectores de expresión (figura 3) que poseen características que facilitan la expresión de proteínas por la célula anfitriona del ADN de interés, los cuales pueden  ser expresados de manera constitutiva o inducida. Además de poseer las cuatros características de un vector, estos deben  poseer regiones regulatorias distales o proximales, un promotor (dependiendo del organismo al cual introduciremos el vector se debe colocar el promotor adecuado), un sitio de unión de para el ribosoma, un codón de paro y una secuencia de terminación de la transcripción,   Por ejemplo si se requiere la expresión de un gen eucarionte en una célula procarionte no se puede utilizar el ADN directamente debido a la presencio de intrones ya que la célula bacteriana no tiene la maquinaria para la edición de estos segmentos de gen. Para resolver esta problemática se encontró un método el cual  consiste tomar el ARNm del gen de interés, aislarlo y añadir transcriptasa reversa más un primer hecho de ADN para generar un fragmento hecho de ADN, se elabora una cadena sencilla de ADN y con la transferasa terminal añade un segundo primer para generar la segunda cadena de ADN y obtener un ADN de doble cadena el cual poseer un promotor y un terminador y así la célula procariota poder expresar el gen.

Figura 3.Un vector de expresion además de poseer las cuatros características principales De cualquier vector (verde está el origen de replicación, de azul el marcador de selección, poseer un sitio de clonación múltiple y de rosa está el gen reportero), también debe de poseer un promotor de la transcripción (azul), regiones regulatorias distales y proximales (rosa y blanco) la secuencia de reconocimiento para el ribosoma (gris) un codón de inicio y un codón de paro y una señal de paro de la transcripción.

Clasificacion de los vectores.

Plásmidos.

Son moleculas de ADN de doble cadena  presentes de manera libre en el citosol de bacterias. Los plásmidos de manera natural poseen todas las características que debe poseer un vector de clonación, por ejemplo, estos plásmidos poseen uno o más genes que le confieren resistencia a los antibióticos a la bacteria receptora. Poseen genes de resistencia a metales pesados y para la producción de toxinas
Los plasmidos usados como vectores permiten la adición de ADN de tamaño de 10 kb (figura 4). 

Figura 4. Un ejemplo de un vector de tipo plásmido, el vector es pUC8 que posee un origen de replicación, un gen marcador, un gen reportero y un sitio de clonación múltiple.

Bacteriófago lambda

Se caracteriza debido a que el genona de los bacteriófagos es una molécula de ADN lineal o circular (figura 5) en cadena doble de unas 50kb de largo. Se quitan los genes causantes de la  infección y la lisis celular  del fago, se dejan los sitios cos. Se puede insertar  un fragmento de hasta 25 kb. Este vector tiene ventajas como las siguientes: el ADN se empaca bien en una forma en que es fácil de almacenar y extraer, todo virus que contenga el ADN recombinante es capaz de infectar una célula bacteriana y un virus nos puede dar mas de 100 000 de copias del ADN de interés.

 

Figura 5. Representación grafica del ADN de un bacteriófago, los sitios cos

Son necesarios para que el ADN se pueda volver circular y así pueda ser

Replicado por la maquinaria de la célula anfitriona, además de ser necesarios

para el empaquetamiento del ADN viral.

Comidos

Son vectores combinados, poseen las características de un plásmido (circularidad, origen de replicación, sitio de restricción múltiple, gen reportero, gen marcador) con las características del genoma del bacteriofago lambda (se toman las secuencias cos) que proporciona la característica de empaquetamiento del ADN (figura 6).

Son útiles para clonar insertos de gran tamaño, de hasta 45 kb, especialmente en la preparación de librerías genómicas, ya que disminuyen el número necesario de clonas para que todo el genoma este representado en la genoteca..

Figura 6. Estructura de un comido. Tiene las características de un plásmido como lo es la circularidad, gen marcador, origen de replicación, sitio de restricción múltiple y además posee los genes cos que son representativos del ADN de bacteriófagos.

Cromosoma artificial de levadura (YAC).

Son vectores que se emplean para poder clonar segmentos de ADN mucho más grandes, de hasta un 1000 kb. Son versiones artificiales de un cromosoma normal de levadura, posee tres regiones que le dan funcionalidad a un cromosoma y poder replicar el cromosoma durante la fase S y separarle entre las células hijas durante la mitosis: uno o más orígenes de replicación ( lo que le permite una replicación independiente del genoma de la célula anfitriona) un centrómero permite una segregación correcta de las copias a las células hijas de los cromosomas(CEN: secuencia centromerica) y en cada extremo un telomero que brindan estabilidad al cromosoma (TEL : secuencia telemétrica) (figura 7)

 

Figura 7. La ligación del inserto en un YAC

Cromosoma artificial bacteriano (BAC),

Son vectores bacterianos que  derivan de los plásmidos F. Pueden aceptar fragmentos de ADN de hasta 500kb, contienen un origen de replicación y poseen genes que regulan su capacidad de replicación en la célula anfitriona,  lo que se traduce como una mayor estabilidad de un gen eucarionte al plásmido, gracias a estas características estos vectores se emplean en la elaboración de genotecas eucarióticas. Tienen ventajas sobre los YAC para identificar secuencias a alta velocidad por que pueden clonarse en E. coli que capta con facilidad el plásmido, tiene un tiempo de replicación corto y pueden cultivarse en grandes densidades en medios simples y no afecta al ADN clonado por recombinación.

Figura 8. Este vector posee genes F (Los gens oriS y repE controlan la velocidad de replicación mientras que los gens parA y parB mantienen el número de copias por célula.) CMR (marcador de resistencia cloranfenicol) cosN (sitio cos del fago) HindIII and BamHI sitios de restricción donde se inserta el DNA foráneo y 2 promotores (T7 y Sp6) para transcribir el inserto y  NotI para cortar el fragmento insertado.